非洲豬瘟試劑盒廠家非洲豬瘟試劑盒廠家健康豬與患病豬或污染物直接接觸是非洲豬瘟最主要的傳播途徑，豬被帶毒的蜱等媒介昆蟲(chóng)叮咬也存在感染可能性。

非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

【獸藥名稱】

通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測(cè)試劑盒

漢語(yǔ)拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

英文名稱：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

 商品名稱：無(wú)

【主要成分與含量】試劑盒中含有如下組分:

【用法與判定】

1 用法

1.1待檢樣品釆集、保存及運(yùn)輸

1.1.1樣品釆集

（1） 活豬樣品 無(wú)菌采集抗凝血或血清5mL

（2） 病死豬剖檢樣品或屠宰場(chǎng)剖檢樣品 無(wú)菌采集死豬的牌、肺、腎、扁桃體、淋巴結(jié)、肌肉等組織樣品。2?8°C低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)。

（3） 病豬污染的周邊環(huán)境 采集與病豬相關(guān)場(chǎng)所的糞便、飼料、污水樣品。2?8°C低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)。

1.1.2樣品保存 采集的樣品在2?8°C保存應(yīng)不超過(guò)24小時(shí)，-70°C條件下保存，避免反復(fù)凍 融。

1.1.3樣品運(yùn)輸泡沫箱加冰袋后密封進(jìn)行運(yùn)輸。包裝和運(yùn)輸應(yīng)符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《高致病性動(dòng) 物病原微生物菌（毒）種或者樣品運(yùn)輸包裝規(guī)范》和交通運(yùn)輸部門關(guān)于危險(xiǎn)品運(yùn)輸管理的有關(guān)規(guī)定。

1.2樣品處理

1.2.1血液樣品處理 抗凝血樣品置于離心管中，8000 r/min離心2分鐘取上層血漿，編號(hào)待 檢。非抗凝血樣品置于離心管中，待凝固后，8000 r/min離心2分鐘取200μL上層血清，編號(hào)待檢。

1.2.2組織樣品處理取適量脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體、肌肉等組織，置于研磨器或研磨管中研磨，再加適量生理鹽水混勻，制成約10%的組織勻漿，8000 r/min離心2分鐘，取200μL上 清于RNase/DNase-free無(wú)菌離心管中，編號(hào)備用。

1.2.3環(huán)境樣品處理

1.2.3.1糞便、飼料樣品處理方法取適量的糞便、飼料放入盛有PBS緩沖液的研磨管中研磨混勻，制成約10%的勻漿液.8000 r/min離心2分鐘，取200μL上清于RNase/DNase-free無(wú)菌離心 管中，編號(hào)備用。

1.2.3.2污水樣品處理方法 直接取200μL污水進(jìn)行核酸提取。

1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法進(jìn)行DNA核酸提取。

1.4熒光PCR反應(yīng)：

1.4.1從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液、酶混合液，室溫融化后，2000 r/min離心5秒。設(shè)被 檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照總和為n,則反應(yīng)體系配制如下：

試劑 體系

PCR 反應(yīng)液 17× (n+1) μL

酶混合液        3× (n+1) μL

1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20μL/ 管分裝量將試劑分裝至熒光PCR反應(yīng)管。

1.4.3在上述制備好的熒光PCR反應(yīng)管中分別加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各5μL、處理好的待測(cè)核酸各5μL,終體積25μL/管，蓋好熒光PCR反應(yīng)管蓋，混勻后瞬時(shí)離心，轉(zhuǎn)移到熒光PCR儀器 上。

144將PCR反應(yīng)管放置在熒光PCR儀樣品槽中，在熒光PCR儀上運(yùn)行以下程序：

熒光通道選擇FAM,在PCR擴(kuò)增階段每個(gè)循環(huán)的55℃時(shí)采集熒光信號(hào)。設(shè)置擴(kuò)增體系為25μL, 同時(shí)要選擇passive reference和quencher為none的模式。（注：若熒光PCR儀（如AB17500）按說(shuō)明 書中的反應(yīng)程序設(shè)置后因持溫時(shí)間短無(wú)法運(yùn)行，可將預(yù)擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增條件變更為95C： 5秒 55°C： 30 秒）

2結(jié)果判定

2.1試驗(yàn)有效性判定

陽(yáng)性對(duì)照有典型擴(kuò)增曲線且Ct值≤30.且陰性對(duì)照無(wú)Cl值或無(wú)擴(kuò)增曲線，線形為直線或輕微斜線，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。則判試驗(yàn)結(jié)果有效。否則，此次試驗(yàn)視為無(wú)效。

2.2樣品判定

2.2.1陽(yáng)性：樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35且有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，判定檢出非洲豬瘟病毒核酸。

2.2.2可疑：樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35?38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn) 結(jié)果Ct值仍在35?38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期.則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

2.2.3陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無(wú)Ct值，判定未檢出非洲豬瘟病毒核酸。

【注意事項(xiàng)】（1）實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本試劑盒說(shuō)明書，嚴(yán)格按照操作步驟執(zhí)行，在操作過(guò) 程中對(duì)時(shí)間、試劑體積等精確控制可以獲得好的結(jié)果。

（2） 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定分區(qū)管理，依照配液區(qū)-模板提取區(qū)-擴(kuò)增區(qū)-分析區(qū)順序 進(jìn)行基因檢測(cè)。各區(qū)間人員、器材、試劑及空氣流向應(yīng)有嚴(yán)格要求。

（3） 核酸提取有關(guān)耗村確保潔凈、無(wú)DNase/RNase,提取過(guò)程盡量低溫、快速，完成后進(jìn)入 下一步實(shí)驗(yàn)或凍保。

（4） 對(duì)于頂部采光儀器要帶新的一次性PE手套對(duì)熒光PCR管封蓋，對(duì)于底部采光儀

器要避免徒手或使用過(guò)的手套接觸熒光PCR管底，檢測(cè)過(guò)程中使用不帶熒光物質(zhì)一次性乳膠手套。

（5） 凍存試劑使用前應(yīng)于室溫下*融化，瞬時(shí)離心使液體*沉于管底。避免反復(fù)凍融， 以免影響試劑性能。

（6） 樣品、陽(yáng)性對(duì)照等在使用后及時(shí)封蓋，.避免組分間及氣溶膠等的污染造成假陽(yáng)性。

（7） 擴(kuò)增產(chǎn)物禁止開(kāi)蓋，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)及時(shí)收集，遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行無(wú)害化處理。

【規(guī)格】50頭份/盒

【貯藏與有效期】試劑盒置-20°C以下避光保存，有效期12個(gè)月。

【批準(zhǔn)文號(hào)】獸藥生字163668871

【生產(chǎn)企業(yè)】鄭州中道生物技術(shù)有限公司

僅供獸醫(yī)診斷使用